1. Identificación híbrida de protoplastos vegetales:
La fusión de protoplastos, la identificación del producto de fusión de protoplastos es necesaria para cuantificar la frecuencia de fusión y para monitorear los productos de fusión. La frecuencia de fusión puede variar debido a la cantidad de protoplastos o las condiciones de fusión.
La identificación preliminar del producto de fusión se realiza bajo microscopio. La identificación microscópica se basa en las diferencias entre las células parentales con respecto a la pigmentación, la presencia de cloroplastos, la tinción nuclear, el marcador citoplásmico, etc.
Un sistema que se ha utilizado con éxito consiste en fusionar protoplastos de células mesófilas de la hoja que contienen cloroplastos con los de cultivos celulares que carecen de cloroplastos. En la etapa inicial, se observa que los productos de fusión a nivel de microscopio de luz contienen cloroplasto en una mitad y gránulos de almidón incoloros en la otra mitad.
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Como resultado, la célula fusionada se puede distinguir fácilmente de los protoplastos parentales no fusionados. Del mismo modo, el protoplasto de pétalo de flor suele estar vacuolado y pigmentado. Por lo tanto, los productos de fusión de protoplastos entre el pétalo-mesófilo o el protoplasto de cultivo de células pétalo se pueden identificar fácilmente.
Si ambos tipos de protoplastos parentales se parecen, es decir, ya sea incoloros o pigmentados, los productos de fusión se pueden distinguir mediante la técnica de tinción nuclear. Una célula híbrida contiene dos núcleos de dos protoplastos parentales diferentes. Dichas células dicarióticas pueden identificarse utilizando un procedimiento convencional de extracción de acetoorceína o acetocarmino.
Pero la presencia de dos núcleos parentales diferentes en la célula híbrida, es decir, la condición hetero-dicariótica, se puede distinguir con mayor precisión usando la técnica de tinción de carbol-fuschin porque carbol-fuschin tiñe de manera diferente dos núcleos parentales.
Los fluorocromos no tóxicos se utilizan a menudo para la identificación de productos heterocariónicos o de fusión. Por ejemplo, el isotiocianato de fluoresceína (FITC) o el isotiocianato de rodamina (RITC) o la rodamina B se utilizan como fluorocromos.
La ventaja de usar fluorocromos para la identificación de productos de fusión es que no depende de los tipos de protoplastos que se usen. Por ejemplo, en un experimento de fusión, los heterocariones entre protoplastos de células en suspensión marcados con FITC y protoplastos mesófilos no marcados exhiben una fluorescencia verde manzana de FITC y una fluorescencia roja de la clorofila de la pareja mesófila.
2. Selección híbrida de protoplastos vegetales:
En la mezcla de protoplastos fusionados y no fusionados, estos últimos suelen predominar. Por lo tanto, después de colocar estos protoplastos mixtos en el medio sólido, es muy difícil identificar microscópicamente las células híbridas. Por otro lado, en la mayoría de los experimentos de fusión, la tasa de división del protoplasto fusionado es relativamente baja.
Al mismo tiempo, uno o ambos protoplastos parentales no fusionados también pueden dividirse y muy pronto el protoplasto híbrido ya no puede distinguirse de las células parentales. Por lo tanto, se requieren algunos tipos de técnicas de selección a nivel de cultivo para recuperar células híbridas y su tejido calloso después de la fusión.
Dado que el comportamiento cultural de los protoplastos y sus requerimientos de nutrientes y hormonas pueden variar de una planta a otra, se han desarrollado varios procedimientos de selección.
3. Aislamiento híbrido de protoplastos vegetales:
Varios métodos de selección, como se describió anteriormente, no son aplicables para la selección de todos los tipos de productos de fusión a nivel cultural. A veces, la selección es tan específica para una hibridación somática intergénica particular. Varias líneas celulares mutantes se utilizan a menudo en algunos métodos de selección. Pero tales métodos están limitados por el hecho de que las líneas celulares mutantes no son fáciles de conseguir en las plantas.
Nuevamente, se ha observado que, en el producto de fusión, la eliminación de cromosomas puede ocurrir a partir de los productos fusionados. Por lo tanto, el uso de complementación mutante o genética puede fallar en los intentos de selección de híbridos producidos a partir de géneros sexualmente incompatibles ampliamente divergentes.
Para superar la limitación de los métodos de selección, recientemente se aíslan físicamente los productos de fusión posteriores a la fusión antes de cultivarlos en un medio sólido o líquido.
Los métodos de aislamiento híbrido se dan a continuación:
(i) Técnica de micropipeta:
Kao (1977) desarrolló esta técnica por primera vez. Mediante esta técnica, los heterocariones se aíslan de la suspensión de protoplastos tratada con fusógeno, bajo un microscopio usando micropipeta. Pero muy pocos heterocariones se obtienen por mucho tiempo y esfuerzo.
(ii) Fraccionamiento en gradiente de densidad de la suspensión de protoplasto después de la fusión:
Harms y Potrykus (1978) utilizaron esta técnica para aislar heterocariones de protoplastos a gran escala. La suspensión de protoplastos después de la fusión se suspende en solución de KMC (volumen igual de KCl1 0.35 M, MgCl 0.245 M
2
, 0.254 MCaCl
2
pH 6.0, 660 ± 20 mOs / kg H
2
0) y se coloca en la parte superior de los gradientes de densidad de KMC / sacarosa isoosmóticos.
Los gradientes se centrifugan a 20 ° C durante 5 minutos a 50-100 g. Los protoplastos fusionados formarán una banda en posición de densidad intermedia. Los heterocariones se pipetean cuidadosamente con pipetas Pasteur y se examinan bajo el microscopio para determinar el número. Finalmente, los heterocariones se lavan una vez con medio de cultivo líquido antes de sembrar.
4. Eventos post-fusión de protoplastos vegetales:
Después de la fusión de la membrana, el citoplasma y sus orgánulos de ambos protoplastos parentales se mezclan entre sí y dicha mezcla forma un citoplasma heteroplásmico. Ofrece la oportunidad de obtener heterocigosidad de material cromosómico extra. Esta fusión difiere de un cigoto en que no existe una herencia materna estricta de los orgánulos citoplasmáticos.
En el protoplasto fusionado, normalmente, se establece una condición dicariótica. Significa que la proporción de 1: 1 núcleo de cada especie ocurre con mayor frecuencia en el citoplasma heteroplásmico. Se pueden observar dos tipos de afecciones dikaryotic.
Pocos protoplastos fusionados pueden ser homocariones que resultan de la fusión de protoplastos parentales similares, pero tienen poca importancia en la hibridación somática. Otros son heterocariones que se forman por la fusión de protoplastos parentales diferentes.
Por lo tanto, la población de protoplastos en cultivo está compuesta por una mezcla de protoplastos parentales no fusionados y protoplastos homocarióticos y heterocarióticos fusionados. A veces, más de dos protoplastos participan en la fusión y producen células gigantes multinucleadas incapaces de mitosis y desarrollo posterior (Fig. 6.20).
Heterokaryon puede producir células híbridas o cíbridas. Sólo la fusión nuclear tiene lugar en el caso de células híbridas. Este evento se puede detectar un día después de la fusión y requiere varias horas para completarse. La fusión nuclear posiblemente se produce a través de la formación de puentes de membrana nuclear. La fusión nuclear forma un synkaryon que contiene una cromatina mixta.
A veces, los núcleos de la condición hetero-dicariótica no se fusionan para formar un synkaryon y un núcleo de cualquiera de los padres puede eliminarse en las etapas de desarrollo posteriores. Por lo tanto, una célula cíbrida se produce con el genoma nuclear de cualquier compañero y el citoplasma de ambos padres (Fig. 6.21).
Los protoplastos híbridos o cíbridos regeneran una pared a su alrededor y entran en el ciclo mitótico. Dado que los protoplastos diploides se usan generalmente para la hibridación somática, debe esperarse un híbrido somático tetraploide. Pero, particularmente en el nivel cruzado amplio (inter-genérico, interespecífico), tal célula tetraploide se considera un anfidiploide.
En cruces amplios, algunos o varios de los cromosomas de un padre pueden eliminarse durante la segregación. Se ha encontrado que en las células híbridas entre Glycine max y Nicotiana glauca, donde se eliminan la mayoría de los cromosomas más grandes de N. glauca.
En ciertos cruces, algunos cromosomas de ambos progenitores se eliminan como en el híbrido entre Arabidopsis thaliana y Brassica campestris. La diferencia en los tiempos del ciclo mitótico en especies que no son compatibles sexualmente puede resultar en dicha eliminación de cromosomas.
Una célula híbrida o cíbrida experimenta divisiones mitóticas y, en última instancia, forma el tejido del callo. Las plantas híbridas o cíbridas completas pueden regenerarse a partir de dicho tejido de callo. Sin embargo, hasta la fecha, la regeneración de plantas se ha logrado con éxito para solo un pequeño número de especies de plantas y se limita principalmente a algunas especies interespecíficas compatibles sexualmente.
En la mayoría de los otros casos, particularmente en especies sexualmente incompatibles, los informes de regeneración de plantas son muy limitados.
5. Importancia de la fusión de protoplastos y la hibridación somática:
La fusión de protoplastos y la hibridación somática han abierto un nuevo camino en la ciencia de las plantas. Ahora es un hecho bien conocido que la hibridación somática en plantas se puede utilizar en la mejora de plantas. Uno de ellos es la producción de híbridos que no es posible a través de la fusión sexual normal o el proceso de fertilización.
En otras palabras, incluye la formación de híbridos somáticos entre dos especies que son sexualmente incompatibles. Por lo tanto, la fusión de protoplastos proporciona un método para combinar los diferentes genomas de diferentes géneros y especies, con el potencial de superar la barrera de incompatibilidad sexual entre las plantas. A continuación se ofrece una breve lista de plantas híbridas somáticas producidas mediante fusión de protoplastos.
(a) Hibridación interespecífica:
(i) Combinación Sexualmente Compatible:
Daucus carota + D. capillifolius, Nicotiana glauca + N. langsdorffii, N. tabacum + N. alata, Petunia parodii + P. hybrida, Solanum tuberosum + S. chacoense.
(ii) Combinación Sexualmente Incompatible:
Datura innoxia + D. Candida Nicotiana, sylvestris + N. knightiana, N. tabacum + N. nesophila, Petunia parodii + P. parviflora.
(b) Hibridación Intergénica:
Arabidopsis thaliana + Brassica campestris, Daucus carota + Aegopodium podagaria, Solanum tuberosum + Lycopersicon esculentum.
La mezcla citoplásmica obtenida a partir de fusiones de protoplastos es novedosa con la oportunidad para la producción de cíbridos junto con la oportunidad para la formación de recombinantes mitocondriales. Las mitocondrias pueden segregar o recombinar sus ADN para formar un nuevo tipo de mitocondrias.
Los cloroplastos se segregan, pero no parecen sufrir recombinación. Así, con la producción de híbridos o cíbridos, la mezcla de citoplasma de ambos protoplastos parentales puede mejorar los elementos genéticos nucleares adicionales. En la hibridación sexual, solo el citoplasma materno, es decir, el citoplasma de la célula del huevo, participa en la formación del híbrido (Fig. 6.22).
Los cíbridos se producen generalmente debido a la eliminación del genoma total de un progenitor después de la fusión de dos protoplastos.
Si un núcleo parental desaparece por completo, el citoplasma de los dos protoplastos parentales todavía están hibridados y el producto de fusión se conoce como híbrido o heteroplasto citoplásmico. Pero se ha encontrado que el uso de un cierto compuesto como la citocalasina extruye completamente el núcleo del protoplasto, lo que produce protoplastos enucleados.
La fusión del protoplasto enucleado con el protoplasto nucleado puede conducir a la producción de un cíbrido somático estéril masculino donde la esterilidad masculina está presente en el citoplasma.
En el experimento, el cíbrido también puede surgir de las siguientes maneras:
1. Fusión entre un protoplasto nucleado normal y un protoplasto que contiene un núcleo no viable;
2. Eliminación de uno de los núcleos después de la formación de heterocariones;
3. Eliminación selectiva de cromosomas en la etapa posterior.
La formación de cíbridos tiene alguna aplicación en el programa de mejora de plantas. La importancia de la cibidez ha sido confirmada por experimentos de reproducción. La transferencia de citoplasma masculino citoplásmico estéril por fusión de protoplastos a híbridos somáticos debe ser de interés para los fitomejoradores. Esto puede ser de importancia crítica en la producción de semillas híbridas basadas en esterilidad masculina.
La eliminación de cromosomas en el producto de fusión se puede usar para el mapeo de genes como en los productos de fusión de células animales. Los estudios de productos de fusión pueden proporcionar información sobre la compatibilidad o incompatibilidad de los núcleos o el citoplasma.
En los últimos años se ha enfatizado repetidamente que el cultivo de tejidos vegetales, per se, parece ser una fuente de variación genética inesperadamente rica; esto ha estimulado el esfuerzo para descubrir si dicha variación genética puede mejorarse mediante la clonación de protoplastos. Esta oportunidad indudablemente conducirá a la producción de nuevas variaciones genéticas.
Mediante la fusión de protoplastos, es posible transferir algunos genes útiles como la resistencia a enfermedades, la fijación de nitrógeno, la tasa de crecimiento rápido, la calidad de las proteínas, la resistencia a las heladas, la resistencia a la sequía, etc. de una especie a otra y, por lo tanto, ampliar la base genética para el fitomejoramiento.
El vigor híbrido es bien conocido en la hibridación sexual y se ha sugerido que la hibridación somática puede producir un vigor aún mayor en los híbridos. Se requiere una evaluación crítica de esta sugerencia, ya que podría dar lugar a mejores rendimientos en muchos cultivos.
En el caso de plantas de reproducción vegetativa, la variación genética se puede inducir a través de la fusión de protoplastos de dos especies, variedades o dos géneros diferentes. En el caso de la caña de azúcar, que es vegetativa, la producción de híbridos somáticos entre diferentes variedades seguida de la regeneración de plantas enteras puede producir variedades mejoradas que pueden ser altamente beneficiosas para la industria de la caña de azúcar.
Se puede obtener una ventaja similar en la papa y otras plantas hortícolas para su mejoramiento.