Para acelerar el aislamiento genético de las plantas mediante clonación posicional, los sistemas de vectores adecuados tanto para la marcha de los cromosomas como para la complementación genética son altamente deseables. Por lo tanto, desarrollamos un vector de cromosoma artificial (TAC) competente para la transformación, pYLTAC7, que puede aceptar y mantener grandes fragmentos de ADN genómico de forma estable tanto en Escherichia coli como en Agrobacterium tumefaciens . Además, tiene las secuencias cis requeridas para la transferencia de genes mediada por Agrobacterium a las plantas. Clonamos grandes fragmentos de ADN genómico de Arabidopsis thaliana en el vector y mostramos que la mayoría de los fragmentos de ADN se mantuvieron estables. Varios clones de TAC que llevaban fragmentos de ADN genómico de 40 a 80 kb se transfirieron de nuevo a Arabidopsis con alta eficiencia y se demostró que se heredaron fielmente entre la progenie. Además, demostramos la utilidad práctica de este sistema de vectores para la clonación posicional en Arabidopsis . Se construyó un contig TAC en la región del locus SGR1 y clones individuales con ca. Se probaron las inserciones de 80 kb por su capacidad para complementar los defectos gravitrópicos de una línea mutante homocigótica. La complementación exitosa permitió que la ubicación física de SGR1 se delimitara con alta precisión y confianza.
Los enfoques genéticos moleculares se han aplicado al análisis y la clonación de genes de plantas, particularmente aquellos involucrados en procesos biológicos complejos, como la regulación del desarrollo y las cascadas de expresión génica (1, 2). Los genes definidos por mutaciones se aíslan mediante clonación posicional, así como mediante el etiquetado de ADN. Para la clonación posicional, se han dedicado esfuerzos a producir numerosos conjuntos de marcadores de ADN y bibliotecas de ADN genómico de varias especies de plantas mediante el uso de cromosomas artificiales propagados en el cromosoma artificial de levadura (YAC) o en el cromosoma artificial de bacterias (BAC y P1) (3–5) . Por lo tanto, un mapeo inicial de los loci de los genes diana utilizando marcadores de ADN y el posterior aislamiento de fragmentos de ADN genómicos grandes y superpuestos en la región diana mediante la caminata o el aterrizaje de los cromosomas se han vuelto más fáciles en varias especies de plantas, incluida la Arabidopsis thaliana (1) y el arroz (6) .
La prueba de la identificación exitosa de genes y la clonación generalmente requiere la complementación del fenotipo mutante por transformación con un alelo de tipo salvaje. El principal inconveniente de la clonación posicional, sin embargo, es la dificultad de reducir el campo de los clones candidatos a un número manejable para las pruebas de complementación. Para el mapeo a escala fina de un locus de mutación, generalmente es necesario analizar cerca de mil progenies (generalmente F
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plantas) o incluso más si el lugar cae en una “zona fría de recombinación”, una región cromosómica de baja frecuencia de recombinación (7). Además, incluso los niveles bajos de errores de puntuación durante el mapeo (debido a la sutileza o la penetración incompleta del fenotipo mutante) reducirán la precisión del mapeo hasta el punto de que la clonación se vuelve impráctica. Además, incluso después de un mapeo preciso, los procedimientos actuales de clonación posicional que utilizan clones YAC o BAC requieren la subclonación de muchos fragmentos pequeños en un vector competente para la transformación para pruebas de complementación. En muchos casos, estos pasos son obstáculos limitantes de la velocidad para la clonación posicional. Por lo tanto, para acelerar la clonación posicional, es altamente deseable explotar una estrategia que agilice las pruebas de complementación.
Los vectores competentes para la transformación de plantas, como el vector cósmido pOCA18 (8) y el vector del fago λTI2 (9), se han desarrollado para la construcción de bibliotecas genómicas con insertos de 5 a 25 kb que se utilizan para la complementación genética de mutantes. La baja capacidad de clonación de estos vectores, sin embargo, limita su utilidad para el aislamiento eficaz de genes mediante clonación posicional. En un informe anterior sobre una biblioteca de ADN genómico de Arabidopsis preparada utilizando un vector de fago P1 (10), sugerimos que si los fragmentos de ADN grandes pudieran transferirse directamente desde los clones basados en P1 a las plantas, aceleraría enormemente la clonación posicional de los genes de las plantas. Recientemente, un fragmento de ADN humano de 150 kb se transfirió al genoma del tabaco utilizando un vector binario-BAC mediante la transformación mediada por Agrobacterium (11, 12). Aquí presentamos un sistema de vectores para la construcción de bibliotecas de cromosomas artificiales (TAC) competentes para la transformación. Nuestros resultados muestran que los grandes fragmentos de ADN genómico de A. thaliana clonados en un vector TAC se pueden mantener de forma estable tanto en Escherichia coli como en Agrobacterium tumefaciens , transferidos con una alta eficacia al genoma de Arabidopsis y heredados fielmente en la progenie transgénica. También mostramos que los clones de TAC que llevan ca. Los fragmentos de ADN genómico de 80 kb de A. thaliana complementan una mutación gravitrópica en el locus sgr1 .